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邻位连接技术简介

如何提高蛋白质检测的特异性和灵敏度是我们一直不断探索的问题,在现已找到的各种答案中,邻位连接技术(proximity ligation assay,PLA)是最令人满意的解决方案之一。与常用的其它蛋白质检测方法相比,PLA 在兼备高特异性和高灵敏度的同时还具有快速灵活和高通量、多功能等优点。除在蛋白质检测方面的应用外,PLA 还可用于检测各种生物样本(包括亚细胞结构、细胞和组织)和研究大分子间的相互作用(包括蛋白质- 蛋白质相互作用和DNA-蛋白质相互作用)。该技术在从建立到现在的短短十年内取得了飞速发展,并正逐步被应用于医学和生物学等众多领域。

 

1  PLA 的基本原理

PLA技术吸取了适体技术、连接酶技术和Taqman 探针技术的精华,并糅合了ELISA、滚环复制的一些核心理念。该技术的基本原理是:一对邻位探针通过其适体部分与被测蛋白特异性结合,接着这对邻位探针通过其辅助核酸序列与同一条连接探针互补结合,然后连接酶以连接探针为模板将两条邻位探针的辅助核酸序列连接起来,从而形成一条完整的单链。加入引物、Taqman 探针和Taq 酶后,上游引物以此条完整单链为模板合成互补链,形成DNA 双链;之后便是一个完整的Taqman 探针实时PCR 过程,最后通过检测荧光信号便可知道被测蛋白的存在及其含量。

    

      2 PLA 的主要类型

    从不同的分类角度出发,PLA 可分为多种不同的类型。依照反应过程中是否需要分离未结合的邻位探针,可将PLA分为均相、固相和原位3 种类型。均相PLA 不需要进行洗脱来去除多余的邻位探针,而固相PLA 和原位PLA 均需要进行洗脱;此外,原位PLA 采用滚环复制,可实现蛋白的原位检测。根据邻位探针的类型可将PLA 分为适体PLA 和抗体PLA,适体PLA 采用适体来特异性结合被测蛋白,而抗体PLA 则通过抗体和被测蛋白抗原进行特异结合。从同时可检测的蛋白质种类来看,PLA 最初一次仅能检测一种蛋白质,接着发展到可同时检测数种蛋白质,而目前通过与芯片技术结合,已能够同时对数百种甚至上千种蛋白质进行检测。

     

         3 PLA 的突出特点

        PLA 具有特异、灵敏、快速、灵活、高通量和多功能等特点,但与当前常用的蛋白质检测技术相比,其最突出的特点是特异性和灵敏度的完美结合。ELISA 方法检测蛋白质具有较好的特异性和灵敏度,但与PLA 相比,其灵敏度相差甚远。PLA 能够在1微升样品中检测出fmol 级的蛋白质分子,其灵敏度为ELISA 的1000 倍。而与免疫PCR 相比,PLA 的灵敏度与其相当,但特异性却显著优于前者。因此,PLA 不但拥有非常好的灵敏度,而且具备很好的特异性,从而展现出了其它方法难以企及的应用前景。

 

PLA技术的应用

 

        1. 应用PLA 检测细胞因子、酶和受体

    到目前为止,可应用PLA 检测的细胞因子包括PDGF、VEGF、EGF、TNF-α、IGF-2、IL-1α、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10 等等[5~7],可检测的酶包括凝血酶、组织蛋白酶、羧肽酶、整合素样金属蛋白酶8 等。此外,应用原位PLA 检测各种受体也相继被报道,例如检测PDGF 受体、EGF 受体等

 

        2. 应用PLA 检测肿瘤标志物

    现已发现的各类肿瘤标志物中,蛋白质是较为常见的一类,因而PLA 在检测肿瘤标志物方面也能够发挥作用。当前可应用PLA 进行标志物检测的肿瘤主要有胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌。这些肿瘤标志物的PLA 检测均采用抗体结合形式,其灵敏度明显高于现有的ELISA 方法和化学发光法。

 

        3. 应用PLA 检测病原体

    各种病原体诸如细菌、病毒等,其表面均有种属特异性蛋白,通过针对这些蛋白的单克隆抗体构建邻位探针,从而建立特异检测某种病原体的PLA 试验方法。与DNA 检测方法比较,由于单个病原体细胞(或非细胞结构)的表面蛋白数量众多,而其基因组DNA 却为单个拷贝,所以PLA 的模板量较DNA检测的模板数要多,从而具有更高的灵敏度。另外,PLA 检测病原体不需要提取DNA,可直接采用血清进行检测。

 

       4. 应用PLA 检测DNA- 蛋白质间相互作用

        Gustafsdottir 等对经典的PLA 加以改造,建立了可检测DNA- 蛋白质间相互作用的PLA 方法。其实现方式是:首先在目的DNA 片段尾端加上辅助序列构建一条特殊的邻位探针,然后以抗目的蛋白质的单克隆抗体为基础构建另一条抗体型邻位探针;如果蛋白质能与DNA 片段相互结合,两条邻位探针就能靠近并共同结合在连接探针上,继而实现连接并产生阳性结果。与ChIP 技术相比,PLA 在检测P53、HNF-4α 和USF1 与DNA之间相互作用时更具优势,如操作简便、成本较低和假性结合率低等。

 

       5. DNA 甲基化的监测

       Cartron 等通过应用PLA检测DNA 甲基化酶I(DnmtI)与PCNA 间的相互作用,发现二者的结合程度与DNA 甲基化程度存在正相关关系,从而为监测细胞整体DNA 甲基化提供了新的方法。

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