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逆转录病毒介导的DNA转染

    反转录病毒作为基因转移的载体有如下特点:①反转录病毒感染细胞的效率高,基因转移率在10%-100%;②病毒基因转移能将外源基因整合到宿主细胞基因组中外源基因能稳定存在而不丢失;③外源基因整合的拷贝数一般只有一个;④反转录病毒只选择感染分裂细胞;⑤病毒可容纳外源基因的DNA长度为<8Kb。
反转录病毒载体的结构:已切除了病毒的结构基因gag,大部分pol和env,包括两侧的LTR,被选择(标记)基因和目的基因插入的多聚位点所取代,同时还带有包装信号ψ。
(一)可产生特异性逆转录病毒细胞系的建立
  1、逆转录病毒载体进入包装细胞系
    从细胞质粒中产生感染性病毒包括将质粒导入包装细胞系,可从稳定感染细胞中选择病毒产生细胞或用一个包装细胞系暂时产生的病毒感染另一种有不同包装的细胞系,从中选择病毒的产生细胞。
  1.1准备工作(用品):
(1)适当的包装细胞系及培养液
(2)大多数包装细胞系为鼠源的,含有鼠“Helpe病毒”,此病毒可帮助被去除某些功能结构基因的逆转录病毒复制,并包装于蛋白衣壳中。
(3)逆转录病毒质粒DNA常构建成含有抗药基因neo新霉素基因的载体。
(4)Hepes-缓冲液(HeBs)
(5)2mol/L CaCL2
(6)含血清及不含血清培养液
(7)HeBs 15%甘油(HeBs/甘油)
(8)800mg/L(100×聚凝胺)(肝素对抗物)
(9)10%~15%DMSO
(10)10cm、6cm培养皿
(11)24孔、6孔培养板
(12)克隆环
  1.2操作步骤:
(1)转染前,10cm培养皿中接种大约10%~20%皿底面积的包装细胞。
(2)将10μg含抗药基因的逆转录病毒质粒DNA加入0.5mL HeBs中,加入32μL 2mol/L CaCL2,轻振动,加盖30分钟,室温下培养45分钟,直到小的、模糊的兰色沉淀产生。
(3)从包装细胞中弃去旧液,轻轻滴入HeBs-DNA沉淀于细胞培养皿中心,使细胞接触DNA20分钟,每10分钟轻轻摇动培养皿,使溶液均匀,加入10mL培养液,并于37℃放置4小时。
(4)完全吸出培养液,逐滴加入2.5mL的HeBs/甘油,放回培养箱继续培养,如果使用的是ψ2/YCRE/YCRIP/PA317包装细胞系,需培养3.5分钟,若为Q2bn包装细胞系,需培养1.5分钟,或根据不同包装细胞选用不同时间。迅速弃去HeBs/甘油,用10mL培养液洗2次,加入含有血清的5ml培养液培养18~24小时。
(5)取出培养液用0.45μm过滤,可获得含有短期产生病毒的培养上清,-70℃或-80℃贮存,或立即用于其它包装细胞系的感染。
(6)加入10ml培养液于上述已感染的细胞,继续培养2~3天,继续步骤10。
(7)另一包装细胞受感染前1:10或1:20传代。
(8)倒去包装细胞的培养液,加入步骤5获得的病毒。方法如下:
对于10cm培养皿,将0.1至1.0mL病毒贮存液稀释至3~5mL的终体积,加入800mg/L聚凝胺至终浓度为8 mg/L,培养1小时以上。
(9)若10cm培养皿加入10mL培养液,6mL培养皿中应加入4mL培养液,培养2~3天。
(10)步骤6或步骤9得到的感染细胞,2~3天后按1:10或1:20传代,接种于选择培养液培养3天,更换培养液,继续培养3~4天,直至克隆出现。
(11)用克隆环挑出分离的克隆,每个克隆接种24孔板或6孔板中的二个孔,生长至50~90%底部面积。
(12)倒去培养液,换入1倍体积的培养液,继续培养1~3天,收取培养液,马上滴定,或者贮存于-70℃或-80℃。
(13)继续传代克隆细胞直到能被冷冻或被鉴定,若病毒产生克隆被鉴定,10%~15%DMSO保护剂液氮冻存细胞。即产生病毒细胞系建立。
  2、病毒滴度鉴定
在分离产生病毒的克隆后,需进行病毒滴度的测定,常用的方法是用病毒感染目的细胞,可根据载体RNA或蛋白的出现粗略定量分析。

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