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抗体的生物素化标记

基本原理

      本法可使抗体或其它蛋白质的ε-氨基通过手臂与酰化的生物素共价结合。其后,生物素化的分子可应用酶标-亲和素或荧光染料-链霉亲和素复合物来检测。小分子的水溶性生物素对细菌蛋白链霉亲和素具有高度亲和力是本法的设计基础。

试剂及仪器

l         NHSB:N-羟基琥珀酰亚胺生物素(有商品供应)

l         0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液,pH 8.0(见附录)

l         双蒸水(注意去除游离氨基),用以配制碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液

l         DMSO(二甲亚砜,有毒试剂)

l         1 mol/L NH4Cl

l         叠氮钠(有毒试剂)

l         PBS(见附录)

l         10g/L牛血清白蛋白(W/W)PBS液

l         分子筛柱(如G25)

l         电磁搅拌器

l         透析袋(MW CO 8000)

l         铝铂

l         微量移液器

 

操作步骤

1.将待生物素化的蛋白质用0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)或0.5 mol/L硼酸缓冲液(pH 8.6)稀释到1mg/ml,一般实验室应用的生物素化体积为1-2.5ml;

2.交互用0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)或0.5 mol/L硼酸缓冲液(pH 8.6),对蛋白质充分透析;

3.用1ml DMSO 溶解NHSB 1mg;

4.向1ml蛋白质溶液(即含蛋白质1mg)加入120μl NHSB溶液(即含NHSB 120 μg);

5.在室温下持续搅拌,保温2-4小时;

6.加入9.6μL1 mol/L NH4Cl (每25 μg NHSB 加1 μl),在室温下搅拌10分钟;

7.在4℃,对PBS充分透析,以除去游离的生物素;

8.将样品上1ml的分子筛柱,以PBS缓慢洗脱,收集1ml/管,蛋白质在1-3ml之间洗下;

9.最后,样品加入叠氮钠(终浓度0.5g/L)及1.0g/L BSA。将结合产物置4℃,避光保存,亦可加入50%重蒸甘油,置―20℃保存。

质量监测

与酶-或荧光染料-结合的亲和素、链霉亲和素或中和亲和素(neutravidin),通过标准方法(Western blotting 或免疫荧光染色法)测定交联率。

实验要点及说明

1、如在反应混合液中有叠氮钠或游离氨基存在,会抑制标记反应。因此,蛋白质在反应前要对0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液或0.5 mol/L硼酸缓冲液充分透析;

2、所用的NHSB及待生物素化蛋白质之间的分子比按蛋白质表面的ε-氨基的密度会有所不同,选择不当则影响标记的效率,应先用几个不同的分子比来筛选最适条件;

3、用NHSB量过量也是不利的,抗原的结合位点可能因此被封闭,导致抗体失活;

4、由于抗体的氨基不易接近可能造成生物素化不足,此时可加入去污剂如Triton X-100,Tween 20等。

5、当游离ε-氨基(赖氨酸残基的氨基)存在于抗体的抗原结合位点时,或位于酶的催化位点时,生物素化会降低或损伤抗体蛋白的结合力或活性。此时,应试用其它交联方法;

6、生物素还可能与不同的功能基团,如羰基、氨基、巯基、异咪唑基及苯酚基,也可与糖基共价结合(详见参考文献1);

7、交联反应后,应充分透析,否则,残余的生物素会对生物素化抗体与亲和素的结合产生竞争作用;

8、在细胞的荧光标记实验中,中和亲和素的本底低,但由于链霉亲和素含有少量正电荷,故对某些细胞可导致高本底。

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